Creation date in repository: 2018-10-01

Abstract: La polimerasa φ29 (Polφ29) és la replicasa del bacteriòfag φ29 que infecta Bacillus subtilis. És una polimerasa molt utilitzada en PCR isotérmica i en técniques de seqüenciació de genomes complerts (WGA). A més, és un enzim mesòfil i a temperaturas elevades la seva activitat catalítica disminueix. En aquest estudi, s’augmenta la termoestabilitat de la polimerasa φ29 incrementant les interaccions entre els residus de la proteína. Per portar a terme aquest objectiu, s’analitzen dues estrategies diferentes: “alanine scanning” i introducció d’un pont disulfur. Els valors d’energia moestren com el doble mutant Polφ29 K371C-A382C és aquell que augmenta més la termoestabilitat en comparació amb la Polφ29 wild type (Polφ29-WT) (-366,57 kcal/mol y -124,93 kcal/mol respectivament). Per altra banda, la combinació d’ambdues estratègies desestabilitza l’enzim. La polimerasa mutant que es presenta en aquest estudi es podria utilizar en futurs experiments in vitro per analitzar la seva estabilitat a temperaturas elevades per augmentar l’eficiència de la reacció en PCR isotérmica. La polimerasa φ29 (Polφ29) es la replicasa del bacteriófago φ29 que infecta a Bacillus subtilis. Es una polimerasa muy usada en PCR isotérmica y en técnicas de secuenciación de genoma completo (WGA). Además es una enzima mesófila y a temperaturas elevadas su actividad catalítica disminuye. En este estudio, se aumenta la termoestabilidad de la polimerasa φ29 incrementando las interacciones entre los residuos de la proteína. Para llevar a cabo este objetivo, se analizan dos estrategias diferentes: “alanine scanning” y introducción de un puente disulfuro. Los valores de energía muestran como el doble mutante Polφ29 K371C-A382C es el que aumenta más su termoestabilidad en comparación con la Polφ29 wild type (Polφ29-WT) (-366,57 kcal/mol y -124,93 kcal/mol respectivamente). La combinación de ambas estrategias en cambio desestabilizan la enzima. La polimerasa mutante que se presenta en este estudio se podría utilizar en futuros experimentos in vitro para analizar su estabilidad a temperaturas elevadas para aumentar la eficiencia de la reacción en PCR isotérmica.

Subject: Bioquímica i biotecnologia

Language: spa

Subject areas: Bioquímica i biotecnologia Biochemistry and biotechnology Bioquímica y biotecnología

Department: Bioquímica i Biotecnologia

Student: del Río García, Alejandro

Academic year: 2017-2018

Title in different languages: Enginyeria de proteïnes per augmentar la termoestabilitat de la polimerasa del bacteriòfag Φ29 Protein engineering to enhance the thermoestability of Φ29 phage polymerase Ingeniería de proteínas para aumentar la termoestabilidad de la polimerasa del bacteriófago Φ29

Work's public defense date: 2018-06-27

Access rights: info:eu-repo/semantics/openAccess

Keywords: Enginyeria de proteïnes, polimerasaφ29, termoestabilitat, pont disulfur, interaccions Protein engineering, φ29 polymerase, disulfide bridge, interactions Ingeniería de proteínas, polimerasaφ29, termoestabilidad, puente disulfuro, interacciones

Confidenciality: No

TFG credits: 9

Title in original language: Ingeniería de proteínas para aumentar la termoestabilidad de la polimerasa del bacteriófago Φ29

Project director: Pujadas Anguiano, Gerard

Education area(s): Biotecnologia

Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)