Creation date in repository: 2019-09-27

Abstract: La proteína fosfatasa de tipo Z 1 (Ppz1) se encuentra únicamente en hongos. Esta fosfatasa, juega un papel importante en la tolerancia osmótica y salina, participa en el mantenimiento de la pared celular y, además, se encuentra implicada en la progresión del ciclo celular. Ha sido observado que la sobreexpresión de esta proteína es tóxica para Sacharomyces cerevisiae, así, se cree que su desregulación podría ser una buena diana para las nuevas terapias antifúngicas. A día de hoy, sólo dos inhibidores de esta fosfatasa han sido descritos, Hal3 y Vhs3. En este trabajo se perseguía el objetivo de caracterizar Vhs2 como supresor de la toxicidad derivada de la sobreexpresión de Ppz1 así como crear dos mutantes diferentes de VHS2 para analizar si la fosforilación/desfosforilación de la proteína tenía algún efecto en la recuperación del fenotipo tóxico provocado por la sobreexpresión de Ppz1. Primeramente, a través de tecnología del ADN recombinante se crearon las dos versiones mutadas de VHS2, en las que se sustituyó la serina 314, por Alanina y Aspártico, mimentizando así una desfosforilación y una fosforilación de la proteína, respectivamente. Posteriormente se llevaron a cabo ensayos de crecimiento en los que se notificó que las cepas que presentaban sobreexpresión de Vhs2 eran capaces de revertir la toxicidad más efectivamente que las cepas wild type pero no de la misma manera que lo hacen aquellas cepas que sobre expresan HAL3. Además, en estos ensayos, también se reveló que no existían diferencias entre los fenotipos de los dos mutantes de Vhs2 estudiados durante el proyecto. Por último, los resultados de los estudios de immunoblotting, sugirieron que la sobreexpresión de Ppz1 causa del aumento de los niveles de expresión de Vhs2. Sin embargo, no se percibió una relación directa entre los niveles de expresión de ambas proteínas. Protein phosphatase type Z 1 (Ppz1) is found only in fungi. This phosphatase plays an important role in osmotic and saline tolerance, participates in the maintenance of the cell wall and in addition, it is involved in the progression of the cell cycle. It has been observed that its overexpression is toxic to Sacharomyces cerevisiae, thus, it is thought that its deregulation could be a good target for new antifungal therapies. Until today, only two inhibitors of this phosphatase have been described, Hal3 and Vhs3. In this work, the objective was to characterize Vhs2 as a suppressor of the toxicity derived from overexpression of Ppz1 as well as to create two different mutants of VHS2 in order to analyze if the phosphorylation/dephosphorylation of the protein has any effect on recovery of the toxic phenotype caused by Ppz1 overexpression. Firstly, through recombinant DNA technology, two mutated versions of VHS2 were created, in which Serine 314 was replaced by Alanina and Aspartic, thus mermining a dephosphorylation and a phosphorylation of the protein, respectively. Subsequently, growth trials were carried out in which it was reported that strains overexpressing Vhs2 were able to reverse toxicity more effectively than wild type strains but not in the same way that the strains that overexpress Hal3. In addition, in these same trials it was also revealed that there were no differences between the phenotypes of the two Vhs2 mutants studied during the project. Finally, the results of the immunoblotting studies suggested that the overexpression of Ppz1 causes the increase in expression levels of Vhs2. However, no direct relationship was found between the expression levels of both proteins. La proteïna fosfatasa de tipus Z 1 (Ppz1) es troba únicament en fongs. Aquesta fosfatasa, juga un paper important en la tolerància osmòtica i salina, participa en el manteniment de la paret cel·lular i a més, es troba implicada en la progressió del cicle cel·lular. Ha estat observat que la sobreexpressió d’aquesta proteïna és tòxica per Sacharomyces cerevisiae, així, es creu que la seva desregulació podria ser una bona diana per a les noves teràpies antifúngiques. A dia d’avui, només dos inhibidors d’aquesta fosfatasa han estat descrits, Hal3 i Vhs3. En aquest treball es perseguia l’objectiu de caracteritzar Vhs2 com a supressor de la toxicitat derivada de la sobreexpressió de Ppz1 així com crear dos mutants diferents de VHS2 per tal d’analitzar si la fosforilació/defosforilació de la proteïna tenia algun efecte en la recuperació del fenotip tòxic provocat per la sobreexpressió de Ppz1. Primerament, a través de tecnologia de l’ADN recombinant es van crear les dues versions mutades de VHS2, en les quals es va substituir la serina 314, per Alanina i Aspàrtic, mimentitzant així una desforsforilació i una fosforilació de la proteïna, respectivament. Posteriorment es van dur a terme assajos de creixement en els que es va notificar que les soques que presentaven sobreexpressió de Vhs2 eren capaces de revertir la toxicitat més efectivament que les soques wild type però no de la mateixa manera que ho fan aquelles soques que sobreexpressen Hal3. A més en aquests assajos, també es va revelar que no existien diferències entre els fenotips dels dos mutants de Vhs2 estudiats durant el projecte. Per últim, els resultats dels estudis d’immunoblotting, van suggerir que la sobreexpressió de Ppz1 causa l’augment dels nivells d’expressió de Vhs2. Tot i això, no es va percebre una relació directa entre els nivells d’expressió d’ambdues proteïnes.

Subject: Bioquímica i biotecnologia

Language: cat

Subject areas: Bioquímica y biotecnología Biochemistry and biotechnology Bioquímica i biotecnologia

Department: Bioquímica i Biotecnologia

Student: Tinoco Gil, Natàlia

Academic year: 2018-2019

Title in different languages: Caracteritzación de vhs2 como supressor multicopia de la toxicidad por sobre expressión de la fosfatasa ppz1 Vhs2 caracterization as a multicopy supressor of the ppz1 overexpression toxicity Caracterització de vhs2 com a supressor multicòpia de la toxicitat per sobre expressió de la fosfatasa ppz1

Work's public defense date: 2019-09-12

Access rights: info:eu-repo/semantics/openAccess

Keywords: saccharomyces cerevisiae, ppz1, vhs2 saccharomyces cerevisiae, ppz1, vhs2 saccharomyces cerevisiae, ppz1, vhs2

Confidenciality: No

TFG credits: 9

Title in original language: Caracterització de vhs2 com a supressor multicòpia de la toxicitat per sobre expressió de la fosfatasa ppz1

Project director: Cordero Otero, Ricardo Román

Education area(s): Biotecnologia

Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)