Creation date in repository: 2019-10-08

Abstract: Rheumatoid Arthritis (RA) is an autoimmune disease characterised by chronic inflammation in the joints. M1-like macrophages have been associated with the synovial inflammation observed in the pathology due to the release of pro-inflammatory cytokines. Nowadays, the main treatments for RA target the inflammatory pathways. While several therapies with different mechanisms of action exist, they do not work in all patients. Also, RA patients sometimes develop antibodies against these drugs. Protease-activated receptor 2 (PAR2) has been proposed as a possible therapeutic target since the receptor has been linked to the severity of RA. However, the mechanism by which PAR2 drives RA pathology is unclear and until recently, a suitable inhibitor has not been available. The aim of this study was to characterise the function of PAR2 in M1-like macrophages and investigate its possible inhibition with the recently reported PAR2 inhibitor, AZ8838. THP-1 cells were differentiated with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) to an M1-like macrophage phenotype. The cells were stimulated with several molecules (lipopolysaccharide (LPS) and the PAR2 activating peptides FLIGRLO-NH2 and SLIGKV-NH2) in the presence or absence of AZ8838. Culture supernatants were collected after 24 hours. ELISA was used to measure the cytokine profile, with changes in cell morphology also analysed. Cell viability was investigated using an MTT assay. PMA differentiated macrophages released high amounts of pro-inflammatory cytokines related to RA (IL-6, IL-8 and TNFα). Moreover, the activation of PAR2 enhanced the inflammatory response as evidence by IL-6 secretion, suggesting that the inhibition of PAR2 in M1-like macrophages is a potential treatment for this disease. However, AZ8838 was not able to inhibit PAR2 activity at the concentrations studied. Therefore, different concentrations of AZ8838 and macrophage PAR2 activators should be tried in future investigations. Finally, neither AZ8388 or any of the stimulators used affect the viability of the cells. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la inflamación crónica de las articulaciones. Los macrófagos similares a M1 se han asociado con la inflamación sinovial observada en la patología ya que secretan citoquinas proinflamatorias. Hoy en día, los principales tratamientos de la AR se dirigen hacia la inflamación, pero, aunque existen diferentes mecanismos de acción, no dan buenos resultados en todos los pacientes. El protease-activator receptor 2 (PAR2) ha sido propuesto como una posible diana del tratamiento ya que se ha asociado a una AR más severa. Sin embargo, el rol de PAR2 en la patología no es claro y, hoy en día, no existe un inhibidor adecuado. El objetivo del estudio es caracterizar la función de PAR2 en macrófagos similares a M1 e investigar su posible inhibición con AZ8838. Las células THP-1 fueron diferenciadas con phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) en macrófagos similares a M1. Las células fueron estimuladas con diferentes moléculas (lipopolisacárido (LPS) y los péptidos activadores de PAR2 FLIGRLO-NH2 y SLIGKV-NH2) en presencia o absencia de AZ8838. La técnica ELISA fue utilizada para estudiar el perfil de citoquinas, la técnica MTT para la viabilidad celular i también se analizaron los cambios en la morfología de las células. Los macrófagos diferenciados con PMA secretan altas cantidades de citoquinas proinflamatorias relacionadas con la AR (IL-6, IL-8 y TNFα). Además, la activación de PAR2 mejora la respuesta inflamatoria con la secreción de IL-6, sugiriendo que la inhibición de PAR2 en este tipo de macrófagos es potencial para el tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, AZ8838 no fue capaz de inhibir la actividad PAR2 en las concentraciones estudiadas. Por lo tanto, diferentes concentraciones de AZ8838 y activadores de PAR2 deberían ser estudiadas en futuras investigaciones. Finalmente, ni AZ8838 ni los estimuladores utilizados afectaron la viabilidad celular. L’artritis reumatoide (AR) és una malaltia autoimmune caracteritzada per la inflamació crònica de les articulacions. Els macròfags semblants a M1 han estat associats amb la inflamació sinovial observada en la patologia ja que secreten citoquines proinflamatòries. Avui en dia, els principals tractaments per l’AR es apunten a la inflamació però, tot i que existeixen diferents mecanismes d’acció, no donen bons resultats en tots els pacients. El protease-activator receptor 2 (PAR2) ha estat proposat com una possible diana de tractament ja que s’ha associat a una AR més severa. Tot i això, el rol de PAR2 en la patologia no és clar i, a dia d’avui, no existeix un inhibidor adequat. L’objectiu de l’estudi és caracteritzar la funció PAR2 en macròfags semblants a M1 i investigar la seva possible inhibició amb AZ8838. Les cèl·lules THP-1 van ser diferenciades amb phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) a macròfags semblants a M1. Les cèl·lules van ser estimulades amb diferents molècules (lipopolisacàrid (LPS) i els pèptids activadors de PAR2 FLIGRLO-NH2 i SLIGKV-NH2) en presència o absència d’AZ8838. La tècnica ELISA va ser utilitzada per estudiar el perfil de citoquines, la tècnica MTT es va utilitzar per comprovar la viabilitat cel·lular i també es van analitzar els canvis en la morfologia de les cèl·lules. Els macròfags diferenciats amb PMA secreten altes quantitats de citoquines proinflamatòries relacionades amb l’AR (IL-6, IL-8 i TNFα). A més, l’activació de PAR2 millora la resposta inflamatòria amb la secreció d’IL-6, suggerint que la inhibició de PAR2 en aquests tipus de macròfags és potencial pel tractament de la malaltia. Tot i això, AZ8838 no va ser capaç d’inhibir l’activitat PAR2 a les concentracions estudiades. Per tant, diferents concentracions d’AZ8838 i activadors de PAR2 haurien de ser estudiades en futures investigacions. Finalment, ni AZ8838 ni els estimuladors utilitzats van affectar la viabilitat cel·lular.

Subject: Bioquímica i biotecnologia

Language: en

Subject areas: Bioquímica y biotecnología Biochemistry and biotechnology Bioquímica i biotecnologia

Department: Bioquímica i Biotecnologia

Student: Fortuny Martí, Lídia

Academic year: 2018-2019

Title in different languages: Rol de PAR2 en macrófagos similares a M1 asociados con AR Role of PAR2 in M1-like macrophages associated with RA Rol de PAR2 en macròfags semblants a M1 associats amb AR

Work's public defense date: 2019-06-27

Access rights: info:eu-repo/semantics/openAccess

Keywords: PAR2, artritis reumatoide, macrófagos PAR2, rheumatoid arthritis, macrophages PAR2, artritis reumatoide, macròfags

Confidenciality: No

TFG credits: 9

Title in original language: Role of PAR2 in M1-like macrophages associated with RA

Project director: Poblet Icart, Maria Montserrat

Education area(s): Biotecnologia

Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)