Palabras clave: Tècniques independents de cultiu, lisi cel·lular, VBNC Culture-independent techniques, cell lysis, VBNC Técnicas independientes de cultivo, lisis celular, VBNC

Título en diferentes idiomas: Anàlisi de l'estabilitat d'ARN ribosomal per la detecció i quantificació de llevats vínics mitjançant RT-qPCR Analysis of ribosomal RNA stability for the detection and quantification of wine yeast through RT-qPCR Analisis de la estabilidad del ARN ribosomal para la detección y cuantificación de levaduras vínicas usando RT-qPCR

Áreas temàticas: Indústries agroalimentàries Food and agricultural industries Industrias agroalimentarias

Confidencialidad: Si

Curso académico: 2015-2016

Codirector del trabajo: Wang, Chunxiao

Estudiante: Sunyer Figueres, Mercè

Departamento: Bioquímica i Biotecnologia

Fecha de la defensa del trabajo: 2016-09-09

Creditos del TFM: 15

Director del proyecto: Mas Barón, Albert

Resumen: RESUM Algunes espècies de llevats vínics en forma viable però no cultivable tenen un paper important durant la fermentació alcohòlica, afectant al producte vínic final, per això és important detectar-les i quantificar-les. S’estan fent avenços en usar tècniques independents de cultiu per obtenir el nombre total de cèl·lules viables, però encara no s’ha trobat una molècula diana per quantificar totes les cèl·lules vives, i no quantificar les mortes. L’objectiu d’aquest estudi és determinar la capacitat del rRNA com a marcador de cèl·lules viables, mitjançant l’anàlisi de la seva estabilitat en cèl·lules lisades. Primer, es va provar l’efecte de diferents tractaments de lisi en una soca de S. cerevisiae i tres de no-Saccharomyces, i mentre les altes temperatures, l’etanol i l’antimicrobià DMDC lisaven totalment aquests llevats, l’antibiòtic cicloheximida i els diferents mètodes de disrupció cel·lular (pressió mecànica, sonicació i congelació-descongelació) no els lisaven. Tot seguit es va determinar la quantitat de rRNA durant 48h després de lisar les cèl·lules mitjançant altes temperatures i DMDC. Per fer la quantificació es va extreure el RNA, que mitjançant RT-PCR es va passar a cDNA, que es va quantificar usant qPCR. Els resultats suggereixen que el rRNA és estable durant 48h després de la lisi cel·lular, a falta de fer tests estadístics per determinar la significança dels resultats. Paral·lelament, es va determinar que s’ha de fer un tractament de lisi abans del protocol d’extracció de RNA usat en aquest estudi per obtenir una quantificació real. En conjunt, sembla que el rRNA no és un bon marcador de viabilitat cel·lular en els llevats vínics usats. Per tant, s’han de continuar buscant un marcador per quantificar cèl·lules viables. Paraules clau: Saccharomyces, Hanseniaspora, Starmerella, Torulaspora, tècniques independents de cultiu, lisi cel·lular, VBNC, DMDC, alta temperatura, qPCR. ABSTRACT Some wine yeasts in VBNC state have an important role during alcoholic fermentation, affecting the final wine, thus it is important to detect and quantify them. Advances are being achieved on culture-independent techniques to obtain the total number of live cells, but nowadays there is not a target able to quantify all live cells, and not the dead ones. The aim of this study is to determine the capacity of rRNA to be a viable cell marker, through the analysis of its stability in lysed cells. First, the effect of different lysis treatment was tested in a strain of S. cerevisiae and three strains of non-Saccharomyces. Treatments with high temperatures, ethanol and antimicrobial DMDC lysed the yeast completely, but the antibiotic cylcloheximide and the different cellular disruption methods (mechanical pressure, sonication and freezing-thawing) did not lyse them. After that, we quantified the rRNA during 48h after lysing the cells (with heat and DMDC). In order to do this quantification, the RNA was extracted and through RT-PCR it was transformed into cDNA, which was quantified with qPCR. The results suggested that rRNA is stable during 48h after cellular lysis, but statistical tests are needed to determine the results significance. At the same time, it was determined that it is necessary to do a lysis treatment before the RNA extraction protocol used here to obtain a real quantification. To sum up, it seems that rRNA is not a good cellular viability marker in the used wine yeast. Therefore, it is necessary to keep looking for a marker to quantify viable cells. Keywords: Saccharomyces, Hanseniaspora, Starmerella, Torulaspora, culture-independent techniques, cell lysis, VBNC, DMDC, heat, qPCR. RESUMEN Algunas especies de levaduras vínicas en forma viable pero no cultivable tienen un papel importante durante la fermentación alcohólica, afectando al producto vínico final, por eso es importante detectarlas y cuantificarlas. Se están haciendo avances en el uso de técnicas independientes de cultivo para obtener el número total de células viables, pero aún no se ha encontrado una molécula diana capaz de cuantificar todas las células vivas, y no cuantificar las muertas. El objetivo de este estudio es determinar la capacidad del rRNA como marcador de células viables mediante el análisis de su estabilidad en células lisadas. Primero se testó el efecto de distintos tratamientos de lisis en una cepa de S. cerevisiae y tres de no-Saccharomyces, y mientras las altas temperaturas, el etanol y el antimicrobiano DMDC lisaban totalmente estas levaduras, el antibiótico cicloheximida y los distintos métodos de disrupción celular (presión mecánica, sonicación y congelación-descongelación) no los lisaban. Después se determinó la cantidad de rRNA durante 48h después de lisar las células mediante altas temperaturas y DMDC. Para hacer la cuantificación, se extrajo el RNA, que mediante RT-PCR se pasó a cDNA, que se cuantificó usando qPCR. Los resultados sugieren que el rRNA es estable durante 48h después de la lisis celular, a falta de hacer tests estadísticos para determinar la significancia de los resultados. Paralelamente, se determinó la necesidad de hacer un tratamiento de lisis antes del protocolo de extracción de RNA usado en este estudio para obtener una cuantificación real. En conjunto, parece que el rRNA no es un buen marcador de viabilidad celular en las levaduras vínicas usadas. Por lo tanto, se tienen que continuar buscando un marcador para cuantificar células viables. Palabras clave: Saccharomyces, Hanseniaspora, Starmerella, Torulaspora, técnicas independientes de cultivo, lisis celular, VBNC, DMDC, alta temperatura, qPCR.

Materia: Indústia Agroalimentària

Entidad: Universitat Rovira i Virgili (URV)

Idioma: Anglès

Enseñanza(s): Begudes Fermentades

Título en la lengua original: Analysis of ribosomal RNA stability for the detection and quantification of wine yeast through RT-qPCR

Fecha de alta en el repositorio: 2017-06-29