Ingeniería de proteínas para aumentar la termoestabilidad de la polimerasa del bacteriófago Φ29

Identificador:  TFG:1623

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TFG1623

Autores:  del Río García, Alejandro

Resumen:
La polimerasa φ29 (Polφ29) es la replicasa del bacteriófago φ29 que infecta a Bacillus subtilis. Es una polimerasa muy usada en PCR isotérmica y en técnicas de secuenciación de genoma completo (WGA). Además es una enzima mesófila y a temperaturas elevadas su actividad catalítica disminuye. En este estudio, se aumenta la termoestabilidad de la polimerasa φ29 incrementando las interacciones entre los residuos de la proteína. Para llevar a cabo este objetivo, se analizan dos estrategias diferentes: “alanine scanning” y introducción de un puente disulfuro. Los valores de energía muestran como el doble mutante Polφ29 K371C-A382C es el que aumenta más su termoestabilidad en comparación con la Polφ29 wild type (Polφ29-WT) (-366,57 kcal/mol y -124,93 kcal/mol respectivamente). La combinación de ambas estrategias en cambio desestabilizan la enzima. La polimerasa mutante que se presenta en este estudio se podría utilizar en futuros experimentos in vitro para analizar su estabilidad a temperaturas elevadas para aumentar la eficiencia de la reacción en PCR isotérmica.