Identificador: TDX:291
Autors: Campàs i Homs, Mònica
Resum:
El objetivo de esta tesis ha sido diseñar, caracterizar y optimizar un array de sensores de ADN electroquímico. Para el estudio de la inmovilización de las sondas de oligonucleótidos y la detección de la hibridación se realizaron experimentos preliminares con un sistema simplificado. Dicho sistema demostró que las monocapas auto-ensambladas (SAMs) en superficies de oro eran apropiadas como método de inmovilización. Debido al rápido desarrollo de los sensores de ADN hacia los arrays de ADN, se modificó la estrategia. La nueva estrategia se basó en la electrodeposición dirigida de nanomódulos de bioreconocimiento en electrodos de resolución fotolitográfica. Dichos nanomódulos, nanopartículas de oro coloidal modificadas con oligonucleótidos, se sintetizaron racionalmente después de haber estudiado las condiciones bajo las cuales las suspensiones de oro coloidal eran estables. Mediante técnicas de fluorescencia y colorimetría se caracterizó la eficacia de las conjugaciones, la funcionalidad de los oligonucleótidos conjugados y la estabilidad térmica de la modificación, experimentos que demostraron que los conjugados eran aptos para la detección de la hibridación. Después de su caracterización, los nanomódulos de bioreconocimiento fueron electrodepositados en distintas superficies electródicas y se demostró la inmovilización dirigida mediante varias técnicas, como la microscopía óptica y electrónica, y técnicas colorimétricas, piezoeléctricas y electroquímicas. Además, los nanomódulos de bioreconocimiento depositados eran funcionales y capaces de diferenciar 4 mutaciones en oligonucleótidos de 19 bases. A pesar de los prometedores resultados, los cuales demostraron la viabilidad de utilizar la electrodeposición dirigida como técnica de arraying, se observó la necesidad de amplificar la señal electroquímica, puesto que los valores obtenidos del sistema eran muy parecidos a los valores obtenidos de los blancos. Siguiendo dos objetivos paralelos para la amplificación de la señal electroquímica (aumentar intrínsecamente las constantes de transferencia de electrones entre encimas y electrodos, y optimizar los sistemas de reciclaje electroquímicos), se diseñaron racionalmente complejos de osmio y se evaluó la cinética de transferencia de electrones entre dichos complejos y encimas redox. En estos estudios cinéticos se observó que los mediadores con carga global más positiva y con potenciales redox más altos proporcionaban constantes de transferencia de electrones más altas, también favorecidas a alto pH y baja fuerza iónica, demostrando la posibilidad de amplificar las señales electroquímicas. Esta tesis está dividida en siete capítulos. El primer capítulo es una introducción que explica los principios fundamentales y el estado de la ciencia en el área de los sensores y arrays de ADN, que sienta las bases del comportamiento de las suspensiones de oro coloidal y que presenta la cinética de transferencia de electrones entre mediadores y enzimas. El segundo capítulo describe el desarrollo de un método preliminar para caracterizar la inmovilización y detectar la hibridación en sensores de ADN. En el tercer capítulo se presentan estudios de estabilidad de las suspensiones de oro coloidal, conjugaciones de oligonucleótidos a dichos coloides y la caracterización de la eficacia de dichas conjugaciones, de la estabilidad de las suspensiones de las conjugaciones, y de la funcionalidad de los conjugados. En el cuarto capítulo se demuestra la electrodeposición dirigida y selectiva en varias superficies electródicas mediante varias técnicas de caracterización. En el quinto capítulo se obtienen las constantes de transferencia de electrones entre la Glucosa Oxidasa (GOx) y distintos complejos de osmio, y se analiza el efecto de varios parámetros experimentales en dichas constantes. Finalmente, un sexto capítulo establece las conclusiones de la tesis y un séptimo capítulo propone varias líneas de investigación a desarrollar en un futuro.
Repositori URV