Temperature modulated genosensor for detection of cystic fibrosis mutations

Identificador:  TDX:367

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TDX367

Autors:  Nasef, Hany Abdel Hady Abdel Rahman

Resum:
La memoria de la tesis está organizada en 8 capítulos. Un resumen de cada capítulo se detalla a continuación. El Capítulo 1 es una Introducción, en la que se presenta el estado del arte así como los objetivos de la tesis. En el Capítulo 2 se describe el uso de la impedancia electroquímica a diferentes temperaturas para la discriminación de la mutación DF508 con respecto a la secuencia normal sin mutación. Las sondas de DNA (de 15 y 21 bases de longitud) fueron inmovilizadas en la superficie de los electrodos de oro y de la variación de la resistencia a la transferencia de carga (Rct) fue medida en función de la hibridación. Para la detección se han utilizado dos tipos de secuencias diana: secuencias sintéticas 15 mer y dos análogos sintéticos de productos de PCR de 82 (mutante) y 85 (normal) bases. La hibridación con la secuencia corta resulto en una variaciones de Rct muy específicas a la secuencia estudiada, con un factor de discriminación a temperatura ambiente de 5 veces cuando se comparó la respuesta obtenida con la secuencia totalmente complementaria con respecto a las no coincidentes. Sin embargo, en el caso de los productos de PCR sintéticos de cadena sencilla el factor de discriminación fue menor (1.5 veces). Por ellos, el efecto de la temperatura fue investigado como vía para mejorar la discriminación. El uso de lavados post-hibridación a temperatura elevada dio lugar a una mejora de 5 veces en el factor de discriminación. De esta manera, utilizando arrays de electrodos inmovilizadas con sondas selectivas a las secuencias de tipo mutante y normal, se logró una detección inequívoca de la mutación DF508. En el Capítulo 3 se describe el uso del azul de metileno como indicador electroquímico en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuenc