Quantificació, Identificació i Tipificació de llevats mitjançant lús de diferents tècniques moleculars

Identificador:  TDX:447

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TDX447

Autors:  Hierro Crivillé, Núria

Resum:
La fermentació alcohòlica és un procés microbià complex que es caracteritza per una successió de diferents espècies de llevats. Llevats amb una baixa activitat fermentativa, com són Candida spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Rhodotorula spp. i Kluyveromyces spp., són predominants en el most i durant els primers dies de fermentació. Posteriorment, Saccharomyces cerevisiae prolifera, domina i completa la fermentació alcohòlica. Els llevats anomenats no-Saccharomyces spp. poden contribuir a les propietats aromàtiques i composició química del vi resultant. No obstant, aquests llevats poden ser tant beneficiosos com perjudicials. Per a un bon control del procés de vinificació, els cellers necessiten mètodes ràpids, senzills i fiables per a la identificació i tipificació de llevats a l'igual que per detectar i enumerar llevats.Els objectius d'aquesta tesi eren: (i) desenvolupar tècniques moleculars per a la caracterització, identificació i quantificació llevats vínics, (ii) avaluar la utilitat d'aquestes tècniques per identificar i quantificar llevats aïllats de mostres reals de fermentacions alcohòliques. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar els oligonucleòtids basats en repeticions d'elements palindròmics extragèniques (REP) i repeticions d'elements consensus entobacterials intergènics (ERIC) descrits en bacteris per caracteritzar soques de llevats de referència. També vam avaluar la utilitat dels primers complementaris a ISS (intron splice site) amb el mateix objectiu. També vam desenvolupar la PCR a temps real o PCR quantitativa (QPCR) per detectar i quantificar de manera ràpida el nombre total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en vi sense cultiu en placa i també vam realitzar la reacció de la transcriptasa inversa i posteriorment QPCR (RT-QPCR) a partir de rRNA per a la quantificació de llevats totals viables. Posteriorment, vam validar totes aquestes tècniques amb mostres reals de vi.Vam caracteritzar 41 soques de referència pertanyents a 15 espècies amb tres tècniques: PCR-ISS, ERIC-PCR i REP-PCR. Vam demostrar la reproduïbilitat de les tècniques, però amb la tècnica REP-PCR vam detectar alguns problemes de reproduïbilitat. Els patrons d'amplificació REP-PCR de soques de la mateixa espècie eren idèntics i amb la PCR-ISS i ERIC-PCR vam detectar alguns polimorfismes en soques de la mateixa espècie. Malgrat aquesta variabilitat intraespecífica, les soques de la mateixa espècie mostraven força bandes espècie-específiques que permetien la identificació del llevat. Per tant, les tres tècniques són útils per a una ràpida, senzilla i relativament barata identificació de llevats.Posteriorment, demostràrem la utilitat d'aquestes tècniques per monitoritzar la diversitat de llevats durant una vinificació industrial. Vam avaluar com la dinàmica de creixement dels llevats no-Saccharomyces spp. podia veure's afectada per la pràctica de la maceració en fred, i per el grau de maduresa del raïm. La meitat dels aïllats eren Candida stellata. Hanseniaspora uvarum i H. osmophila. Els altres aïllats eren identificats com a espècies minoritàries. Com a conclusions generals, podem indicar quecom més alt el grau de maduresa, més alta la proporció de C. stellata en el most. També, sembla que la maceració en fred afavoreix la presència de H. osmophila, C. tropicalis i Z. bisporus.També vam desenvolupar la tècnica de la QPCR per detectar i quantificar la població total de llevats, Saccharomyces spp. i Hanseniaspora spp. en una mostra de vi. Els assaigs de QPCR eren conduits primer sobre cultius purs de soques de llevats de referència per tal de detectar l'especificitat dels primers. Més tard, validàrem aquesta tècnica amb vi contaminat artificialment i amb mostres reals de vi i comparàrem els resultats obtinguts amb aquells obtinguts per cultiu en placa per determinar l'eficàcia de la QPCR. Vam obtenir una bona correlació entre el número predit de UFC per QPCR i per plaqueig. La detecció de RNA mitjançant PCR prèvia reacció de la transcriptasa inversa (RT-PCR), es considera un millor indicador de viabilitat que la detecció de DNA. Vam comparar la quantificació dels llevats totals per plaqueig i per QPCR utilitzant DNA i utilitzant RNA. El recompte obtingut amb els tres mètodes fou similar.