Identificador: TDX:815
Autores: Villamizar Gallardo, Raquel Amanda
Resumen:
Los microorganismos están presentes en una gran variedad de orígenes, incluyendo alimentos, agua, animales, medio ambiente también como en el propio cuerpo humano. Estos pueden ser beneficiosos o perjudiciales. Los microorganismos perjudiciales reciben el nombre de patógenos y su detección es de gran importancia por razones de salud y seguridad. Es bien conocido que los alimentos contaminados con bacterias pueden producir cierto número de enfermedades. Como consecuencia de esto, miles de euros se invierten cada año en tratamientos médicos para mantener la salud de la población. Existen más de 250 enfermedades transmitidas por alimentos. En las últimas décadas se ha incrementado por ejemplo, la incidencia de brotes de salmonelosis en muchos países, siendo Salmonella Infantis uno de los agentes etiológicos más importantes asociados con la producción de esta enfermedad entérica. Debido a la amplia distribución de los microorganismos, estos pueden llegar también a contaminar alimentos durante su cultivo como durante la fase de almacenamiento. En este sentido, los hongos filamentosos son en gran parte los agentes etiológicos responsables del deterioro de alimentos después de la cosecha produciendo pérdidas en la calidad y devaluación económica. Por otra parte, las infecciones fúngicas invasivas producidas por levaduras han aumentado considerablemente en los últimos años. Candidiasis, es la enfermedad producida por Candida albicans. Esta es una de las infecciones más comunes que afectan pacientes inmunocomprometidos requiriendo tratamientos de elevado coste. Se han propuesto varios métodos hasta la fecha para la detección de microorganismos patógenos. El cultivo es el método de referencia utilizado para la detección y cuantificación de bacterias. Tiene la ventaja de ser altamente selectivo y sensible pero tiene el inconveniente de requerir varios días para obtener un resultado. Para simplificar y automatizar la identificación de bacterias y hongos se han desarrollado kits bioquímicos rápidos. Aunque los resultados obtenidos usando esta clase de kits son comparables a las pruebas bioquímicas tradicionales, también 1 o 2 días son requeridos para la obtención de resultados. El enzimoinmunoensayo ('Enzyme Linked Immunosorbent Assay', ELISA) es un método immunológico de gran sensibilidad que se utiliza ampliamente para detectar y cuantificar microorganismos patógenos, tanto en el sector médico como en el alimentario. Sin embargo, su principal desventaja es que a veces el tiempo de análisis puede aumentar considerablemente, específicamente cuando se realizan etapas de pre-enriquecimiento de la muestra para disminuir el límite de detección. Como consecuencia, muchos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia el desarrollo de métodos más rápidos. Los métodos basados en el uso de la biología molecular, específicamente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real, son hoy en día las herramientas más comúnmente usadas para la detección de patógenos. Estas técnicas son altamente sensibles y permiten la cuantificación del patógeno. Adicionalmente, se han desarrollado chips con plataformas de DNA para analizar cientos de patógenos simultáneamente. Sin embargo, esta técnica es costosa y requiere el uso de muchos reactivos. La introducción de los biosensores ha contribuído a generar nuevas alternativas para la detección de patógenos. Los biosensores son las herramientas más usadas en la detección de patógenos después de la PCR, los métodos convencionales y el ELISA. Tienen la ventaja de proporcionar respuestas rápidas entre la toma de muestra y la obtención de los resultados. No obstante, el reto para su aplicación en muestras reales radica en alcanzar selectividades y sensibilidades comparables a los métodos convencionales ya establecidos y a un costo económico reducido. Desde que Iijima descubrió los nanotubos de carbono (CNTs) se han publicado numerosos trabajos sobre sus excelentes propiedades electrónicas y ópticas, las cuales, en conjunción con su tamaño, hacen de estas nanoestructuras materiales interesantes en el desarrollo de plataformas de biodetección. Los CNTs presentan una gran capacidad de transferencia de carga entre estructuras heterogéneas. Ello les confiere una gran utilidad en la elaboración de sensores de tipo electroquímico. Su conductividad eléctrica varía de forma muy acusada con cambios en su ambiente químico y, como resultado, se han aplicado con éxito en el estudio de procesos de reconocimiento molecular. Una metodología para la detección directa de biomoléculas integra los CNTs como elementos transductores dentro de una configuración de transistor de efecto campo (FET). Las principales ventajas de esta clase de configuraciones radican en que el canal conductor se localiza sobre la superficie del substrato y, como resultado, es altamente sensible a cualquier cambio en el medio ambiente. Además, los CNTFETs pueden operar a temperatura y, humedad ambientales. Al inicio de esta tesis (2006), todavía no se habían aplicado los CNTFETs basados en nanotubos de carbono monocapa a la detección de bacterias y hongos. Sólo se había estudiado la interacción entre los CNTs y bacterias, pero sin el objetivo de detección. Por tanto, esta tesis aporta los primeros CNTFETs aplicados a la detección de microorganismos patógenos. En primer lugar, se presentan los antecedentes y la introducción, donde se realiza una revisión crítica y actualizada de los métodos e investigaciones más relevantes para detectar microorganismos patógenos. Posteriormente, se incluye un capítulo con la información detallada de todos los procedimientos experimentales, herramientas analíticas y materiales utilizados a lo largo del trabajo de investigación. En los siguientes capítulos, se presenta la aplicación de CNTFETs en la determinación de bacterias, mohos y levaduras mediante artículos científicos publicados a lo largo del desarrollo de la tesis. Brevemente, el primer dispositivo desarrollado se aplicó a la detección de Salmonella Infantis en una matriz simple (solución salina 0.85 %) y se comprobó por primera vez que esta clase de sensores eran capaces de detectar al menos 100 ufc/mL de la bacteria en tan solo una hora con alta selectividad. Seguidamente, se amplió el campo de aplicación a otro tipo de microorganismo, Candida albicans. En este estudio, se mejoró no sólo el límite de detección de los dispositivos a 50 ufc/mL sino que también se mejoró la selectividad de los CNTFETs frente a posibles interferentes que pueden estar presentes en muestras reales, tales como proteínas séricas. Finalmente, se aplicaron los dispositivos a la detección del moho Aspergillus flavus en muestras reales. En este ensayo, el tiempo de respuesta fue de 30 minutos y se obtuvo una buena sensiblidad (10 µg de A. flavus / 25 g de arroz). Como parte final de la tesis, se presentan las conclusiones generales extraídas a lo largo del trabajo completo junto con los anexos. Puede concluirse que, gracias a las propiedades únicas de los nanotubos de carbono, dichos nanomateriales pueden combinarse con entidades biológicas (como los anticuerpos) para obtener biosensores altamente sensibles y selectivos capaces de detectar bacterias, levaduras y mohos en un tiempo de análisis muy reducido. Como trabajo futuro, se deberán estudiar otros parámetros de calidad de los dispositivos tales como la estabilidad a lo largo del tiempo, la robustez o su reutilización con el fin de contrastarlos con los métodos estándar antes de poder iniciar la comercialización de este tipo de sensores.
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