Protein engineering to enhance the thermoestability of Φ29 phage polymerase

Identifier:  TFG:1623

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TFG1623

Authors:  del Río García, Alejandro

Abstract:
La polimerasa φ29 (Polφ29) és la replicasa del bacteriòfag φ29 que infecta Bacillus subtilis. És una polimerasa molt utilitzada en PCR isotérmica i en técniques de seqüenciació de genomes complerts (WGA). A més, és un enzim mesòfil i a temperaturas elevades la seva activitat catalítica disminueix. En aquest estudi, s’augmenta la termoestabilitat de la polimerasa φ29 incrementant les interaccions entre els residus de la proteína. Per portar a terme aquest objectiu, s’analitzen dues estrategies diferentes: “alanine scanning” i introducció d’un pont disulfur. Els valors d’energia moestren com el doble mutant Polφ29 K371C-A382C és aquell que augmenta més la termoestabilitat en comparació amb la Polφ29 wild type (Polφ29-WT) (-366,57 kcal/mol y -124,93 kcal/mol respectivament). Per altra banda, la combinació d’ambdues estratègies desestabilitza l’enzim. La polimerasa mutant que es presenta en aquest estudi es podria utilizar en futurs experiments in vitro per analitzar la seva estabilitat a temperaturas elevades per augmentar l’eficiència de la reacció en PCR isotérmica.