Desenvolupament d’un sistema vectorial dual modular mitjançant clonatge golden gate per a l’anàlisi de l’activitat de ligasa E3 en protoplasts vegetals

Identificador:  TFG:8980

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TFG8980

Autors:  Arjona Martí, Aida

Resum:
Múltiples xarxes d’homeòstasi de proteïnes controlen les proteïnes des de la seva síntesi fins a la seva degradació. L’abundància estacionària de les proteïnes es determina, per tant, pels seus ritmes relatius de producció i degradació. La modificació de les proteïnes amb ubiqüitina en dicta el destí cel·lular, que pot anar des de la reparació de l’ADN i la regulació del cicle cel·lular fins a la degradació mitjançada pel proteasoma. Determinar els efectes estabilitzadors o desestabilitzadors de la modificació amb ubiqüitina per les lligases E3 és sovint un repte, ja que el seguiment dels nivells proteics in vivo depèn freqüentment de sistemes de reporters fàcilment detectables. Per abordar aquesta qüestió, vam desenvolupar un sistema de vectors dual per a l’anàlisi ratiomètrica de l’activitat de les lligases E3 en protoplasts vegetals. Aquests construïts es van generar utilitzant el sistema de clonatge modular Golden Gate, que permet el muntatge “sense cicatriu” de cassets multigènics. Els mòduls de nivell 0 es van assemblar en vectors de nivell 1 per formar unitats transcripcionals completes. El muntatge precís de les columnes vertebrals dels vectors i els inserits es va confirmar mitjançant digestió per restricció i seqüenciació. En total, vam generar set sensors i dos efectors. De cara al futur, aquest sistema serà provat en protoplasts vegetals per avaluar-ne l’expressió òptima. Aquesta plataforma facilitarà el seguiment precís dels efectes de les lligases E3 sobre l’estabilitat de les proteïnes reportadores, proporcionant una eina valuosa per a la investigació de la regulació de proteïnes en plantes.