Desarrollo de un sistema vectorial dual modular mediante clonado golden gate para evaluar la actividad de la ligasa E3 en protoplastos vegetales

Identificador:  TFG:8980

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TFG8980

Autores:  Arjona Martí, Aida

Resumen:
Múltiples redes de homeostasis de proteínas controlan las proteínas desde su síntesis hasta su degradación. La abundancia estacionaria de las proteínas se determina, por tanto, por sus ritmos relativos de producción y degradación. La modificación de las proteínas con ubicuitina dicta su destino celular, que puede ir desde la reparación del ADN y la regulación del ciclo celular hasta la degradación intermediada por el proteasoma. Determinar los efectos estabilizadores o desestabilizadores de la modificación con ubicuitina por las ligasas E3 es a menudo un reto, ya que el seguimiento de los niveles proteicos in vivo depende frecuentemente de sistemas de reporteros fácilmente detectables. Para abordar esta cuestión, fuimos desarrollar un sistema de vectores dual para el análisis ratiométrico de la actividad de las ligasas E3 en protoplastos vegetales. Estos construidos se generaron utilizando el sistema de clonación modular Golden Gate, que permite el montaje “sin cicatriz” de casetes multigénicos. Los módulos de nivel 0 se asemejaron en vectores de nivel 1 para formar unidades transcripcionales completas. El montaje preciso de las columnas vertebrales de los vectores y los insertos se confirmó mediante digestión por restricción y secuenciación. En total, generamos siete sensores y dos efectores. De cara al futuro, este sistema será probado en protoplastos vegetales para evaluar su óptima expresión. Esta plataforma facilitará el seguimiento preciso de los efectos de las ligasas E3 sobre la estabilidad de las proteínas reportadoras, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación de la regulación de proteínas en plantas