Development of a modular dual vector system via golden gate cloning to assay E3 ligase activity in plant protoplasts

Creation date in repository: 2025-11-27

Abstract: Múltiples redes de homeostasis de proteínas controlan las proteínas desde su síntesis hasta su degradación. La abundancia estacionaria de las proteínas se determina, por tanto, por sus ritmos relativos de producción y degradación. La modificación de las proteínas con ubicuitina dicta su destino celular, que puede ir desde la reparación del ADN y la regulación del ciclo celular hasta la degradación intermediada por el proteasoma. Determinar los efectos estabilizadores o desestabilizadores de la modificación con ubicuitina por las ligasas E3 es a menudo un reto, ya que el seguimiento de los niveles proteicos in vivo depende frecuentemente de sistemas de reporteros fácilmente detectables. Para abordar esta cuestión, fuimos desarrollar un sistema de vectores dual para el análisis ratiométrico de la actividad de las ligasas E3 en protoplastos vegetales. Estos construidos se generaron utilizando el sistema de clonación modular Golden Gate, que permite el montaje “sin cicatriz” de casetes multigénicos. Los módulos de nivel 0 se asemejaron en vectores de nivel 1 para formar unidades transcripcionales completas. El montaje preciso de las columnas vertebrales de los vectores y los insertos se confirmó mediante digestión por restricción y secuenciación. En total, generamos siete sensores y dos efectores. De cara al futuro, este sistema será probado en protoplastos vegetales para evaluar su óptima expresión. Esta plataforma facilitará el seguimiento preciso de los efectos de las ligasas E3 sobre la estabilidad de las proteínas reportadoras, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación de la regulación de proteínas en plantas; Multiple protein homeostasis networks control proteins from synthesis to degradation. Protein abundance depends on production and degradation rates. Ubiquitin modification determines cellular fate, including DNA repair, cell-cycle regulation, or proteasome-mediated degradation. Assessing the effects of ubiquitin modification by E3 ligases is challenging, as in vivo monitoring often relies on reporter systems. To address this, we developed a dual vector system for ratiometric analysis of E3 ligase activity in plant protoplasts. Constructs were generated using Golden Gate cloning, assembled into transcriptional units, and verified by sequencing. We produced seven sensors and two effectors, enabling precise monitoring of protein stability.; Múltiples xarxes d’homeòstasi de proteïnes controlen les proteïnes des de la seva síntesi fins a la seva degradació. L’abundància estacionària de les proteïnes es determina, per tant, pels seus ritmes relatius de producció i degradació. La modificació de les proteïnes amb ubiqüitina en dicta el destí cel·lular, que pot anar des de la reparació de l’ADN i la regulació del cicle cel·lular fins a la degradació mitjançada pel proteasoma. Determinar els efectes estabilitzadors o desestabilitzadors de la modificació amb ubiqüitina per les lligases E3 és sovint un repte, ja que el seguiment dels nivells proteics in vivo depèn freqüentment de sistemes de reporters fàcilment detectables. Per abordar aquesta qüestió, vam desenvolupar un sistema de vectors dual per a l’anàlisi ratiomètrica de l’activitat de les lligases E3 en protoplasts vegetals. Aquests construïts es van generar utilitzant el sistema de clonatge modular Golden Gate, que permet el muntatge “sense cicatriu” de cassets multigènics. Els mòduls de nivell 0 es van assemblar en vectors de nivell 1 per formar unitats transcripcionals completes. El muntatge precís de les columnes vertebrals dels vectors i els inserits es va confirmar mitjançant digestió per restricció i seqüenciació. En total, vam generar set sensors i dos efectors. De cara al futur, aquest sistema serà provat en protoplasts vegetals per avaluar-ne l’expressió òptima. Aquesta plataforma facilitarà el seguiment precís dels efectes de les lligases E3 sobre l’estabilitat de les proteïnes reportadores, proporcionant una eina valuosa per a la investigació de la regulació de proteïnes en plantes.

Subject: Clonatge

Language: en

Subject areas: Bioquímica y biotecnología; Biochemistry and biotechnology; Bioquímica i biotecnologia

Department: Bioquímica i Biotecnologia

Student: Arjona Martí, Aida

Academic year: 2024-2025

Title in different languages: Desarrollo de un sistema vectorial dual modular mediante clonado golden gate para evaluar la actividad de la ligasa E3 en protoplastos vegetales; Development of a modular dual vector system via golden gate cloning to assay E3 ligase activity in plant protoplasts; Desenvolupament d’un sistema vectorial dual modular mitjançant clonatge golden gate per a l’anàlisi de l’activitat de ligasa E3 en protoplasts vegetals

Work's public defense date: 2025-09-10

Access rights: info:eu-repo/semantics/openAccess

Keywords: E3 ligasas, sensor ratiométrico, Clonaje Golden gate; E3 ligases, ratriometric sensor, Golden gate cloning; E3 lligases, sensor ratiomètric, clonatge Golden gate

Confidenciality: Si

Title in original language: Development of a modular dual vector system via golden gate cloning to assay E3 ligase activity in plant protoplasts

Project director: Portillo Guisado, Maria del Carmen

Education area(s): Biotecnologia

Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)