Creation date in repository: 2015-02-18

Abstract: Se ha desarrollado una cromatografía líquida de alta resolución (LC) acoplada a detección por espectrometría de masas (-MS/MS) a través de una fuente de ionización química para la determinación de tetrodotoxinas (TTXs) en muestras de pez globo. La separación se basa en la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) en una columna XBridge amida (2,1 mm × 100 mm , 3,5 micras de mida de partícula) y las fases móviles han consistido en acetato de amonio 30 mM a pH 5,8 y acetonitrilo 30 mM de acetato de amonio (90:10), para las fases móviles A y B, respectivamente. El gradiente de elución se ha optimizado utilizando muestras de la especie de pez globo Lagocephalus sceleratus como control positivo, de 100% B a 50% de A en un tiempo de ejecución total de 12 minutos incluyendo el equilibrado de la columna. Los parámetros de detección de la espectrometría de masas se han optimizado por infusión directa del estándar de TTX al espectrómetro, entre otros, un potencial de desagrupación de 50 V y una energía de colisión de 29 i 53 V para las transiciones ion precursor > ion producto de m/z 320>302 i 320>162, respectivamente. La temperatura de la fuente de iones por electroesprai se ha ajustado a 600ºC después del acoplamiento LC para maximizar el rendimiento de ionización. El método de triple cuadrupolo de monitorización de reacciones múltiples (MRM) ha permitido la determinación de 10 tetrodotoxinas diferentes en les muestras de pez globo, incluyendo un pez de la especie Sphoeroides pachygaster pescado en Palamós, costa catalana. Se han obtenido resultados preliminares sobre la validación del método, mostrando buena linealidad en el rango de 25-1250 μg TTX/Kg (r ²=0,999) y un límite de detección muy bajo de 1 μg TTX/Kg. Una evaluación preliminar del pez encontrado en Catalunya ha revelado una toxicidad muy menor en comparación con la de L. sceleratus que es altamente tóxico. S. pachygaster ha mostrado TTX>25 μg/Kg, solo en la piel y a un nivel relativamente bajo 300 μg TTX/Kg. La puesta en marcha y la optimitzación de este método contribuirá en el futuro próximo a llevar a cabo la evaluación del riesgo de la invasión de estos emigrantes lessepsianos del mar Mediterráneo. A high-performance liquid chromatography (LC) coupled with mass spectrometric detection (-MS/MS) via an electrospray ion source has been developed for the determination of tetrodotoxins (TTXs) in puffer fish samples. Separation was based upon hydrophilic interaction chromatography (HILIC) on an XBridge Amide column (2.1mm × 100 mm, 3,5 μm particle size) and mobile phases consisted in 30 mM ammonium acetate at pH 5.8 and acetonitrile/30 mM ammonium acetate (90:10), for mobile phases A and B, respectively. The gradient elution was optimized using positive control samples from the puffer fish species Lagocephalus sceleratus, from 100% B to 50% A in a total run time cycle of 12 min including post-run equilibration. Compound-dependent mass spectrometry detection parameters were optimized by direct infusion of TTX standard to the mass spectrometer, among others, a declustering potential of 50 V and a collision energy of 29 and 53 V for the transitions precursor ion > product ion of m/z 320 > 302 and 320 > 162, respectively. The electrospray ion source temperature was adjusted to 600ºC after LC coupling to maximize the ionization yield. The triple-quadrupolo multi reaction monitoring (MRM) method allowed the determination of 10 different tetrodotoxins in puffer fish samples, including a fish individual of the species Sphoeroides pachygaster caught at Palamós, coast of Catalonia. Preliminary results on method validation have been obtained, showing good linearity in the range 25-1250 μg TTX/Kg (r² = 0.999) and a very low limit of detection of 1 μg TTX/Kg. A preliminary assessment of the puffer fish found in Catalonia revealed a much lower toxicity compared to that found in the highly toxic L. sceleratus, the former showing TTX > 25 μg /Kg only the skin and at relatively low level 300 μg TTX/Kg. The set up and optimization of this method will contribute in the next future to perform the risk assessment of the invasion of these Lessepsian migrants to the Mediterranean Sea. S’ha desenvolupat una cromatografia líquida d'alta resolució (LC) acoblada a detecció per espectrometria de masses (-MS/MS) a través d'una font d'ionització química per a la determinació de tetrodotoxines (TTXs) en mostres de peix globus. La separació es basa en la cromatografia d'interacció hidrofílica (HILIC) en una columna XBridge amida (2,1 mm × 100 mm , 3,5 micres de mida de partícula) i les fases mòbils han consistit en acetat d'amoni 30 mM a pH 5,8 i acetonitril 30 mM d’acetat d'amoni (90:10), per a les fases mòbils A i B, respectivament. El gradient d'elució s’ha optimitzat utilitzant mostres de l'espècie de peix globus Lagocephalus sceleratus com a control positiu, de 100% B a 50% d'A en un temps d'execució total de 12 minuts incloent l'equilibrat de la columna. Els paràmetres de detecció de l’espectrometria de masses s’han optimitzat per infusió directa de l’estàndard de TTX a l'espectròmetre, entre altres, un potencial de desagrupació de 50 V i una energia de col·lisió de 29 i 53 V per a les transicions ió precursor > ió producte de m/z 320>302 i 320>162, respectivament. La temperatura de la font d'ions per electroesprai s’ha ajustat a 600ºC després de l'acoblament LC per maximitzar el rendiment d'ionització. El mètode de triple quadrupol de monitorització de reaccions múltiples (MRM) ha permès la determinació de 10 tetrodotoxines diferents en les mostres de peix globus, incloent un peix de l'espècie Sphoeroides pachygaster atrapat a Palamós, costa catalana. S'han obtingut resultats preliminars sobre la validació del mètode, mostrant una bona linealitat en el rang de 25-1250 μg TTX/Kg (r ²=0,999) i un límit de detecció molt baix d'1 μg TTX/Kg. Una avaluació preliminar del peix globus trobat a Catalunya ha revelat una toxicitat molt menor en comparació amb la de L. sceleratus que és altament tòxic. S. pachygaster ha mostrat TTX>25 μg/Kg, només a la pell i a un nivell relativament baix 300 μg TTX/Kg. La posta en marxa i l’optimització d'aquest mètode contribuirà en el futur pròxim a dur a terme l'avaluació del risc de la invasió d'aquests emigrants lessepsians fins al mar Mediterrani.

Subject: Toxicologia

Language: cat

Work's codirector: Salagre Carnero, M. Pilar

Subject areas: Química Chemistry Química

Department: Química Analítica i Química Orgànica

Student: Gil Pagà, Lourdes

Academic year: 2013-2014

Title in different languages: Desenvolupament d'un mètode de cromatografia de líquids acoblada a un espectròmetre de masses en tàndem per a la determinació de tetrodotoxines Development of a method of liquid chromatography coupled to mass spectrometry for determination of tetrodotoxins Desarrollo de un método de cromatografía de líquidos acoplada a un espectrómetro de masas en tándem para la determinación de tetrodotoxinas

Work's public defense date: 2014-01-29

Access rights: info:eu-repo/semantics/openAccess

Keywords: método, cromatografía de líquidos, tetrodotoxina method, liquid chromatography, tetrodotoxin mètode, cromatografia de líquids, tetrodotoxina

Confidenciality: No

TFG credits: 12

Title in original language: Desenvolupament d'un mètode de cromatografia de líquids acoblada a un espectròmetre de masses en tàndem per a la determinació de tetrodotoxines

Project director: De la Iglesia, Pablo

Education area(s): Química

Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)