Creation date in repository: 2018-09-28

Abstract: En aquest estudi, es va investigar la unió d'aptàmers conjugats amb un pèptid antigènic a cèl·lules dendrítiques (DC) per induir la seva activació de manera directa. En conseqüència, les cèl·lules T i altres tipus de cèl·lules efectores del sistema immunitari també s'activarien a causa de la unió amb les DC activades. L'objectiu d'aquest estudi era validar l'aptàmer D#7, que ja havia estat provat en altres estudis (Silvana Haβel, 2016). Això vol dir que els DC s'han d'avaluar amb i sense l'aptàmer (conjugat i no conjugat) per saber si els DC s'estaven activant correctament i descartar que no s'estaven produint enllaços inespecífics. També es volia determinar si els aptàmers FN#9, FN#12, FN#14, FN#15 i FN#20 es podrien utilitzar com a molècules d'unió específiques per al desenvolupament d'immunoteràpies contra diverses malalties, per exemple, contra el càncer. Aquests aptàmers es van provar en dues línies cel·lulars: cèl·lules THP1 i J774A1, que són monòcits humans i macròfags de ratolins, respectivament, i en dues condicions diferents (amb tampó d'unió o medi cel·lular). En la validació D#7, es van analitzar 5 receptors cel·lulars diferents (CD40, CD86, MHC-I, MHC-II i CD80) per determinar si estaven regulats a l'alça o a la baixa quan els DC eren activats per LPS (lipopolisacàrids) o MHC- pèptid I ​​(complex major d'histocompatibilitat) mitjançant l'ús d'anticossos conjugats amb un fluoròfor. La unió dels aptàmers i els anticossos es va provar amb citometria de flux. La validació de l'aptàmer D#7 no es va completar perquè la unió de l'aptàmer no era reproduïble i només hi havia un receptor cel·lular que estava regulat (CD40) quan els DC van ser activats pel pèptid LPS o MHC-I. En conseqüència, l'experiment no es va poder continuar per la incoherència dels resultats obtinguts. Pel que fa a les proves dels aptàmers FN#9, FN#12, FN#14, FN#15 i FN#20, es va observar que els aptàmers FN#9 i FN#12 es van unir a les cèl·lules THP1 i J774A1 en ambdues condicions. FN#20 també es va unir a les cèl·lules J774A1. Encara que, en el cas del medi cel·lular, la fluorescència de l'aptàmer era més intensa, per tant, probablement, més quantitat d'aptàmer unit.1700. In this study, the binding of conjugated aptamers with an antigenic peptide to dendritic cells (DCs) in order to induct their activation in a direct way was investigated. In consequence, T cells, and other type of effector cells from the immune system, would also be activated because of the binding with the activated DCs. The aim of this study was to validate the aptamer D#7, which had been already tested in other studies (Silvana Haβel, 2016). This means that, DCs must be evaluated with and without the aptamer (conjugated and non-conjugated) in order to know if DCs were being properly activated and to discard that non-specific bindings were not occurring. It also wanted to be determined if aptamers FN#9, FN#12, FN#14, FN#15 and FN#20 could be used as specific binding molecules for the development of immunotherapies against several diseases, for instance, against cancer. These aptamers were tested in two cell lines: THP1 and J774A1 cells, which are human monocytes and mice macrophages, respectively, and in two different conditions (with binding buffer or cell medium). In the D#7 validation, 5 different cell receptors (CD40, CD86, MHC-I, MHC-II and CD80) were analysed in order to determine if they were upregulated or downregulated when DCs were activated by LPS (lipopolysaccharides) or MHC-I peptide (Major Histocompatibility Complex) by using conjugated antibodies with a fluorophore. The binding of the aptamers and the antibodies was tested with flow cytometry. The validation of the D#7 aptamer was not completed because the binding of the aptamer was not reproducible and there was only one cell receptor that was upregulated (CD40) when the DCs were activated by LPS or MHC-I peptide. Consequently, the experiment could not be continued because of the incoherence of the obtained results. Concerning to the testing of the aptamers FN#9, FN#12, FN#14, FN#15 and FN#20, it was observed that aptamers FN#9 and FN#12 bound to the THP1 and J774A1 cells in both conditions. FN#20 also bound to J774A1 cells. Although, in the case of cell medium, the fluorescence of the aptamer was more intense, so, probably, more quantity of aptamer bound.1700 En este estudio, se investigó la unión de aptámeros conjugados con un péptido antigénico a las células dendríticas (CD) para inducir su activación de forma directa. En consecuencia, las células T, y otro tipo de células efectoras del sistema inmunológico, también se activarían debido a la unión con los CD activados. El objetivo de este estudio fue validar el aptámero D#7, que ya había sido probado en estudios anteriores (Silvana Haβel, 2016). Esto significa que las CDs deben ser evaluadas con y sin el aptámero (conjugado y no conjugado) para saber si están siendo activadas apropiadamente y para descartar que no ocurran uniones no específicas. También se quería determinar si los aptámeros FN#9, FN#12, FN#14, FN#15 y FN#20, podrían utilizarse como moléculas de unión específicas para el desarrollo de inmunoterapias contra varias enfermedades, por ejemplo, contra el cáncer. Estos aptámeros fueron probados en dos líneas celulares: las células THP1 y J774A1, que son monocitos humanos y macrófagos de ratones, respectivamente y en dos condiciones (en Binding Buffer y en medio celular). En la validación D#7 se analizaron 5 receptores celulares diferentes (CD40, CD86, MHC-I, MHC-II y CD80) para determinar si estaban sobre expresados o reprimidos cuando las CDs eran activadas por LPS (lipopolisacáridos) o péptido MHC-I (Complejo de Histocompatibilidad Mayor) mediante el uso de anticuerpos conjugados con un fluoróforo. La unión de los aptámeros y de los anticuerpos fue testada con citometría de flujo. La validación del aptámero D#7 no se completó porque la unión del aptámero no era reproducible y sólo había un receptor celular que estaba sobre expresado (CD40) cuando las CDs fueron activadas por el péptido MHC-I o LPS. En consecuencia, el experimento no se pudo continuar debido a la incoherencia de los resultados obtenidos. Respecto a las pruebas de los aptámeros FN#9, FN#12, FN#14, FN#15 y FN#20, se observó que los aptámeros FN#9 y FN#12 se unieron a las células THP1 y J774A1 en las dos condiciones. FN#20 también se unió a las células J774A1. Aunque, en el caso del medio celular, la fluorescencia del aptámero fue más intensa, así que, probablemente, se unió una cantidad superior de aptámeros.

Subject: Bioquímica i biotecnologia

Language: en

Subject areas: Bioquímica i biotecnologia Biochemistry and biotechnology Bioquímica y biotecnología

Department: Bioquímica i Biotecnologia

Student: Gil Pitarch, Clàudia

Academic year: 2017-2018

Title in different languages: Inducció de la resposta del sistema immunitari a través de l'activació de cèl·lules presentadores d'antigen mitjançant aptàmers conjugats Induction of the immune system response through the activation of antigen presenting cells mediated by conjugated aptamers Inducción de la respuesta del sistema immunitario a través de la activación de células presentadoras de antígeno mediante aptámeros conjugados

Work's public defense date: 2018-06-27

Access rights: info:eu-repo/semantics/openAccess

Keywords: Cèl·lules dendrítiques, aptàmers, SELEX Dendritic cells, aptamers, SELEX Células dendríticas, aptámeros, SELEX

Confidenciality: No

TFG credits: 9

Title in original language: Induction of the immune system response through the activation of antigen presenting cells mediated by conjugated aptamers

Project director: Capilla Luque, Javier

Education area(s): Biotecnologia

Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)