Extensió de primers electroquímica per a la detecció de SNPs emprant dideoxinucleòtids modificats amb polyoxometalats

Identificador:  TFM:183

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TFM183

Autors:  Uribe Uribe, Laura

Resum:
Els “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs), són importants marcadors genètics que tenen utilitat en la identificació de predisposicions a malalties hereditàries, estratificació dels pacients en el futur paradigma de la medicina personalitzada, així com una eina forense avançada. Seguint la identificació de la ubicació de SNPs utilitzant tecnologies de seqüenciació de nova generació (Next Generation Sequencing), les reaccions d'extensió de base es poden usar per a la identificació ràpida d'un SNP present en un lloc conegut del genoma, utilitzant dideoxinucleótidos (ddNTPs) que allarguen en una sola base exactament en el lloc del SNP una doble cadena d'ADN. Un nou enfocament de la reacció PEX prèviament introduït pel nostre grup és l'extensió de base electroquímica (Electrochemical Primer Extension EPEX), on es van assajar dideoxinucleótidos (ddNTPs) marcades amb diferents marcadors electroquímics. En aquest treball, i per primera vegada, ddNTPs marcats amb polioxometalatos (POM) Keggin i Dawson, s'incorporen de manera efectiva mitjançant la reacció EPEX per a allargar sondes d'ADN de cadena simple immobilitzades en elèctrodes d'or utilitzant el gen MYH7 de cardiomiopatía com un sistema model. Identifiquem amb èxit quatre SNPs diferents, corresponents a cadascuna de les bases, mitjançant voltametría de pols diferencial (DPV) amb la finalitat de detectar els ddNTPs incorporats marcats amb marcadors electroquímics. La reacció en cadena de la polimerasa (PCR), es va dur a terme per a amplificar una regió de parells de bases, la qual conté les quatre bases diferents de l'ADN; això com un mitjà per a estimular l'estudi en mostres de pacients reals. Una PCR asimètrica va ser realitzada per a obtenir l'ADN de cadena senzilla que conté els SNPs buscats. Aquests productes van ser posats a prova en la reacció EPEX, on es va obtenir la correcta incorporació del 100% de les bases i detecció dels SNPs de les bases marcades amb POM Dawson. Finalment, aquest estudi representa un avanç important per tal d'aconseguir una plataforma rendible per a la detecció de SNPs en llocs coneguts.