Keywords: SNP, dideoxinucleótido, polyoxometalato Single Nucleotide Polymorphism, Dideoxynucleotides, Polyoxometalates. SNP, dideoxinucleòtid, polioxometalat
Title in different languages: Extensión de primers electroquímica para la detección de SNPs usando dideoxinucleótidos modificados con polyoxometalatos Electrochemical Primer Extension for the Detection of Single Nucleotide Polymorphism Using Dideoxynucleotides Labeled with Polyoxometalates Extensió de primers electroquímica per a la detecció de SNPs emprant dideoxinucleòtids modificats amb polyoxometalats
Subject areas: Ingeniería química Chemical engineering Enginyeria química
Confidenciality: No
Academic year: 2015-2016
Work's codirector: Ortiz, Mayreli
Student: Uribe Uribe, Laura
Department: Enginyeria Química
Access Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Work's public defense date: 2016-09-08
TFM credits: 24
Project director: O'Sullivan, Ciara
Abstract: Los “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs), son importantes marcadores genéticos que tienen utilidad en la identificación de predisposiciones a enfermedades hereditarias, estratificación de los pacientes en el futuro paradigma de la medicina personalizada, así como una herramienta forense avanzada. Siguiendo la identificación de la ubicación de SNPs utilizando tecnologías de secuenciación de nueva generación (Next Generation Sequencing), las reacciones de extensión de base se pueden usar para la identificación rápida de un SNP presente en un lugar conocido del genoma, utilizando dideoxinucleótidos (ddNTPs) que alargan en una sola base exactamente en el sitio del SNP una doble cadena de ADN. Un nuevo enfoque de la reacción PEX previamente introducido por nuestro grupo es la extensión de base electroquímica (Electrochemical Primer Extension EPEX), donde se ensayaron dideoxinucleótidos (ddNTPs) marcadas con diferentes marcadores electroquímicos. En este trabajo, y por primera vez, ddNTPs marcados con polioxometalatos (POM) Keggin y Dawson, se incorporan de manera efectiva mediante la reacción EPEX para alargar sondas de ADN de cadena simple inmovilizadas en electrodos de oro utilizando el gen MYH7 de cardiomiopatía como un sistema modelo. Identificamos con éxito cuatro SNPs diferentes, correspondientes a cada una de las bases, mediante voltametría de pulso diferencial (DPV) con el fin de detectar los ddNTPs incorporados marcados con marcadores electroquímicos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se llevó a cabo para amplificar una región de pares de bases, la cual contiene las cuatro bases diferentes del ADN; esto como un medio para estimular el estudio en muestras de pacientes reales. Una PCR asimétrica fue realizada para obtener el ADN de cadena sencilla que contiene los SNPs buscados. Estos productos fueron puestos a prueba en la reacción EPEX, donde se obtuvo la correcta incorporación del 100% de las bases y detección de los SNPs de las bases marcadas con POM Dawson. Finalmente, este estudio representa un avance importante para lograr una plataforma rentable para la detección de SNPs en lugares conocidos. Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) are important genetic markers that can be helpful for identifying predisposition to a disease, patient stratification in the future paradigm of personalized medicine as well as an advanced forensic tool. Following identification of the location of SNPs using next generation sequencing technologies, primer extension reactions can be used for rapid identification of which SNP is present at the identified SNP site using dideoxynucleotides (ddNTPs) that will elongate a DNA double strand by just one base exactly at the SNP site. A novel approach of the PEX reaction previously introduced by our group is Electrochemical Primer Extension (EPEX), where dideoxynucleotides (ddNTPs) labelled with different electrochemical markers were tested. In this work, for the first time ddNTPs labelled with Keggin and Dawson polyoxometalates (POMs) are effectively incorporated using the EPEX reaction to elongate immobilized primers using the cardiomyopathy MYH7 gene as a model system. We successfully detected four different SNPs, representing each of the bases, using differential pulse voltammetry to detect the incorporated redox-labelled ddNTPs. The polymerase chain reaction was carried out to amplify a base pair region containing the four different bases, as a means of stimulating real patient samples. Once the target DNA products from asymmetric PCR were obtained, the single stranded DNA were tested in the EPEX reaction obtaining 100% of correct base incorporation and SNP detection for the Dawson POM. This study is an important development to achieve a cost-effective platform for detecting SNPs at identified locations. Els “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs), són importants marcadors genètics que tenen utilitat en la identificació de predisposicions a malalties hereditàries, estratificació dels pacients en el futur paradigma de la medicina personalitzada, així com una eina forense avançada. Seguint la identificació de la ubicació de SNPs utilitzant tecnologies de seqüenciació de nova generació (Next Generation Sequencing), les reaccions d'extensió de base es poden usar per a la identificació ràpida d'un SNP present en un lloc conegut del genoma, utilitzant dideoxinucleótidos (ddNTPs) que allarguen en una sola base exactament en el lloc del SNP una doble cadena d'ADN. Un nou enfocament de la reacció PEX prèviament introduït pel nostre grup és l'extensió de base electroquímica (Electrochemical Primer Extension EPEX), on es van assajar dideoxinucleótidos (ddNTPs) marcades amb diferents marcadors electroquímics. En aquest treball, i per primera vegada, ddNTPs marcats amb polioxometalatos (POM) Keggin i Dawson, s'incorporen de manera efectiva mitjançant la reacció EPEX per a allargar sondes d'ADN de cadena simple immobilitzades en elèctrodes d'or utilitzant el gen MYH7 de cardiomiopatía com un sistema model. Identifiquem amb èxit quatre SNPs diferents, corresponents a cadascuna de les bases, mitjançant voltametría de pols diferencial (DPV) amb la finalitat de detectar els ddNTPs incorporats marcats amb marcadors electroquímics. La reacció en cadena de la polimerasa (PCR), es va dur a terme per a amplificar una regió de parells de bases, la qual conté les quatre bases diferents de l'ADN; això com un mitjà per a estimular l'estudi en mostres de pacients reals. Una PCR asimètrica va ser realitzada per a obtenir l'ADN de cadena senzilla que conté els SNPs buscats. Aquests productes van ser posats a prova en la reacció EPEX, on es va obtenir la correcta incorporació del 100% de les bases i detecció dels SNPs de les bases marcades amb POM Dawson. Finalment, aquest estudi representa un avanç important per tal d'aconseguir una plataforma rendible per a la detecció de SNPs en llocs coneguts.
Subject: Enginyeria química
Entity: Universitat Rovira i Virgili (URV)
Language: Anglès
Education area(s): Nanociència, Materials i Processos - Tecnologia Química de Frontera
Title in original language: Electrochemical Primer Extension for the Detection of Single Nucleotide Polymorphism Using Dideoxynucleotides Labeled with Polyoxometalates
Creation date in repository: 2017-01-13
Repositori URV