Extensión de primers electroquímica para la detección de SNPs usando dideoxinucleótidos modificados con polyoxometalatos

Identificador:  TFM:183

Handle: https://hdl.handle.net/20.500.11797/TFM183

Autores:  Uribe Uribe, Laura

Resumen:
Los “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs), son importantes marcadores genéticos que tienen utilidad en la identificación de predisposiciones a enfermedades hereditarias, estratificación de los pacientes en el futuro paradigma de la medicina personalizada, así como una herramienta forense avanzada. Siguiendo la identificación de la ubicación de SNPs utilizando tecnologías de secuenciación de nueva generación (Next Generation Sequencing), las reacciones de extensión de base se pueden usar para la identificación rápida de un SNP presente en un lugar conocido del genoma, utilizando dideoxinucleótidos (ddNTPs) que alargan en una sola base exactamente en el sitio del SNP una doble cadena de ADN. Un nuevo enfoque de la reacción PEX previamente introducido por nuestro grupo es la extensión de base electroquímica (Electrochemical Primer Extension EPEX), donde se ensayaron dideoxinucleótidos (ddNTPs) marcadas con diferentes marcadores electroquímicos. En este trabajo, y por primera vez, ddNTPs marcados con polioxometalatos (POM) Keggin y Dawson, se incorporan de manera efectiva mediante la reacción EPEX para alargar sondas de ADN de cadena simple inmovilizadas en electrodos de oro utilizando el gen MYH7 de cardiomiopatía como un sistema modelo. Identificamos con éxito cuatro SNPs diferentes, correspondientes a cada una de las bases, mediante voltametría de pulso diferencial (DPV) con el fin de detectar los ddNTPs incorporados marcados con marcadores electroquímicos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se llevó a cabo para amplificar una región de pares de bases, la cual contiene las cuatro bases diferentes del ADN; esto como un medio para estimular el estudio en muestras de pacientes reales. Una PCR asimétrica fue realizada para obtener el ADN de cadena sencilla que contiene los SNPs buscados. Estos productos fueron puestos a prueba en la reacción EPEX, donde se obtuvo la correcta incorporación del 100% de las bases y detección de los SNPs de las bases marcadas con POM Dawson. Finalmente, este estudio representa un avance importante para lograr una plataforma rentable para la detección de SNPs en lugares conocidos.